GutIF19NGS助力改

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胆管良恶性狭窄的鉴别仍是一个诊断难题。年4月10日，美国匹兹堡大学医疗中心卫生系统病理科的AaturDSinghi教授在Gut杂志上发表了题为“Integratingnext-generationsequencingtoendoscopicretrogradecholangiopancreatography(ERCP)-obtainedbiliaryspecimensimprovesthedetectionandmanagementofpatientswithmalignantbileductstrictures”的临床应用研究，本研究开发了一种胆管狭窄良恶性诊断的靶向NGS分析方法BiliSeq，提高了检测的灵敏度和特异性，同时，与常规病理学评价方法的联合检测具有较高的灵敏度和特异性，尤其是对原发性硬化性胆管炎(PSC)患者的检出率。

1.引言

胆管狭窄是一种良性和恶性的异质性疾病。良性胆管狭窄可能是由原发性硬化性胆管炎(PSC)、IgG4相关的硬化性胆管炎、医源性损伤、感染和其他不常见的病因引起，恶性胆管狭窄的原因包括胰胆管癌、肝壶腹癌和罕见的转移性癌症。然而，鉴别良恶性胆管狭窄是关键且具有难度，可依赖于多学科的临床检查方法、生化检测（如血清CA19-9检测）、影像学、内镜检查及辅助技术的病理学评价。考虑到一些良性狭窄的病因可能会诱发恶性肿瘤，这种鉴别就比较困难了。

内镜逆行胰胆管造影(ERCP)在评估胆管狭窄的形态特征和病变程度方面起着关键作用。然而，在透视检查中并没有可以区分良恶性的病理特征，而且直接胆道镜的分级不准确，观察者间的意见一致性差。在ERCP中，胆管刷取物和钳活检是病理确认的首选方法，然而，恶性肿瘤的检测灵敏度在8%到67%之间。为提高恶性狭窄的检出水平，研究者开发了包括数字图像分析、KRAS突变检测和荧光原位杂交在内的辅助技术，然而，这些技术的灵敏度只在14%到60%之间。考虑到病理学评价和辅助技术的低灵敏度，患者经常为诊断进行多次ERCP。因此，恶性狭窄的治疗决策往往延迟数周甚至数月。相反，良性胆管狭窄的误诊会导致不必要的手术切除，手术切除可能会导致较高的发病率和死亡率。因此，需要更多创新的术前方法来提高良恶性狭窄的鉴别。

高通量测序技（NGS）结合了高分析灵敏度和多基因分析，因此是评估胆管狭窄的一个有吸引力的选择。本研究中研究者开发了一种针对胆道系统恶性肿瘤中常发生突变、扩增和/或缺失的28个基因的高灵敏度靶向NGS分析方法，称为BiliSeq，前瞻性地在大量患者中评估BiliSeq检测技术：

(1)确定其检测恶性胆管狭窄的准确性；

(2)比较其与其他辅助技术和诊断技术的性能；

(3)评估发现的基因组改变对病人治疗的影响。

2.材料方法（样本及其处理很重要！）

(1)患者：

trainingcohort样本（年9月-年4月）：57名患者的胆管样本按照标准的ERCP采集；validationcohort样本（年9月-年8月）：名患者的胆管样本按照标准的ERCP采集。总共采集份胆管刷取物和份胆管活检样品进行病理学评价，份胆管刷取物和份胆管活检样品进行BiliSeq检测。胆管标本送往匹兹堡大学医学中心（UPMC）解剖病理实验室进行常规的细胞病理学和病理学评价，UPMC分子和基因组病理学实验室在ERCP采样后的24-48小时内进行BiliSeq检测。检测患者病理记录患者参数、临床表现、ERCP结果、内镜超声(EUS)及EUS-细针吸活组织（FNA）检测、血清CA19-9水平、相应的刷取物和/或活检的病理学诊断。对重复ERCP采集的样本进行单独分析，其中24个刷取物和29个活检进行病理学评价，24个刷取物和29个活检进行BiliSeq检测。狭窄的病因是基于分析了手术切除或活检标本(尸检、开放或腹腔镜手术切除/活检、经皮穿刺或ERCP采集的胆管活检)的诊断学病理(n=)和/或临床标准(n=75)的≥12个月后的追访。因文献报道中胆道刷毛特异性%，故刷取物标本的病理学评价结果不视为诊断学病理，此外，阴性的ERCP活检不认为支持良性结果。如果追访≥12个月的多次成像或ERCP结果证明先前的导管异常已经消除或稳定，那么该狭窄被指定为良性胆管病。相比之下,恶性肿瘤的临床诊断是在没有急性胆管病的情况下大量的组合，放射摄影成像和追访≥12个月后临床或影像学进展相结合考虑，或者临床和放射学诊断为胆管恶性肿瘤而导致死亡。对于手术切除和活检标本，诊断基于标准的组织形态学标准。

(2)样本采集:

ERCP采集包括细胞刷取物、钳活组织检查或两者的混合物。细胞刷取物是在狭窄部位以多次往复运动的方式采集，置于15mL纤溶液中并在24小时内移送样本进行检测，分离的刷取物置于含有洗涤剂-DNA裂解缓冲液的收集瓶中，在24小时内被运送到UPMCMGP实验室进行BiliSeq检测：钳活检也进行类似的处理并分别进行病理学检测和BiliSeq检测。检测时不需要最小的样本细胞。所有的标本处理方式都是一样的。

(3)BiliSeq检测：

NGS预期将作为临床护理的一部分在UPMCMGP实验室进行，该实验室获得了临床实验室改进修正案(CLIA)和美国病理学家学院(CAP)双认证。检测的28个基因为AKT1,ALK,ATM,BRAF,CDKN2A,CTNNB1,EGFR,ERBB2,ERBB4,FGFR1,FGFR2,FGFR3,GNA11,GNAQ,GNAS,HRAS,IDH1,IDH2,KIT,KRAS,MET,NRAS,PDGFRA,PIK3CA,PTEN,SMAD4,TP53,VHL。

(4)靶向基因组改变的分类：

临床相关基因组改变是指目前市场上或注册临床试验中的抗癌药物可靶向的改变基因。

(5)统计学分析：

制定受试者工作特性(ROC)曲线用以比较生物标志物的表现，建立切点水平，并使用Youden指数。根据梯形法的计算结果，选择最终的切口来最大化曲线下面积(AUC)。

3.研究结果

(1)trainingcohort和validationcohort样本的血清CA19-9、病理学评价、BiliSeq检测

基于基因组改变的缺失(阴性)和存在(阳性)的trainingcohort和validationcohort组的临床病理特征如Table1。

考虑到缺乏公认的血清CA19-9数值作为恶性狭窄的标志，我们进行了CA19-9水平的探索性研究。通过ROC曲线分析，血清CA19-9能区分鉴别良恶性狭窄，AUC为0.。使用Youden指数选择≥44U/mL阈值时，升高的CA19-9检测恶性肿瘤的灵敏度为62%，特异性为77%。trainingcohort和validationcohort样本基因组改变只在恶性狭窄中被检测到，而在良性胆管病中不存在（Figure1）。

各检测方法的灵敏度和特异性见Table2，BiliSeq试验可提高常规检测方法检测灵敏度和特异性。

(2)胆管标本亚型分析、原发性硬化性胆管炎(PSC)病史、重复ERCP、生物标记检测

共进行了例胆管刷洗物和例胆管活检，分别进行了病理学评价和BiliSeq检测（Table3）。胆管刷洗物和胆管活检的病理学评价灵敏度分别为35%和52%，特异性分别是98%和%。相比之下，BiliSeq检测两者的灵敏度分别为71%和75%，特异性均为%。个患者中的有37例有原发性硬化性胆管炎(PSC)的病史。重复ERCP采样再进行检测时，提高了病理学评价的灵敏度和特异性，但BiliSeq检测的灵敏度和特异性依然很高。

(3)对比配对ERCP采集的胆管标本和诊断病理学标本的BiliSeq检测

配对ERCP采集的胆管标本中BiliSeq检测到基因组变化比诊断病理标本中检测到的更精准。

(4)与治疗相关的基因组改变和治疗过程的数据

基于之前报道的化疗反应可用靶点和疗效预测标志物，ERCP采集的胆管标本的BiliSeq检测确定了例癌症的20例(13%)中存在与癌症治疗相关的基因组改变，其中大部分病例包含受体酪氨酸激酶(RTK)/Ras/丝裂原活化蛋白(MAP)激酶信号通路改变，包括ERBB2,MET,ALK,FGFR2和FGFR3。

在ERBB2改变的恶性肿瘤中，2例患者，均为腺癌ERBB2拷贝数增加，接受了抗HER2靶向化疗，而没有采用常规化疗。第一例患者是一位老年女患，症状为黄疸，腹痛加重一周，肝功能升高，血清CA19-9为55U/mL,CT扫描显示胆结石和肝内导管扩张，ERCP显示肝内胆管狭窄。采集的胆道刷取物病理学评价显示高度不典型的上皮细胞，疑似腺癌，而BiliSeq检测到ERBB2扩增和TP53突变。2周内，三相CT扫描显示4B/5肝段有2.1cm肝转移灶（Figure2A），血清CA19-9为.4U/mL。再次进行ERCP采集胆道刷取物和活组织，检查确诊为侵袭性中分化腺癌。临床认定肝内胆管癌，患者开始服用吉西他滨、顺铂和曲妥珠单抗；经三个月的治疗，血清CA19-9降至14U/mL，转移灶降至0.6cm；追访时ERCP显示病人胆管狭窄的改善；确诊一年后，血清CA19-9保持在正常范围内，转移病灶最大尺寸为0.3cm（Figure2B）。

第二例患者是一名中年男性，症状为黄疸，上腹痛，肝功能升高，血清升高CA19-9为U/mL，CT显示肝门周围胆管增厚，磁共振胰胆管造影（MRCP）显示上肝门狭窄，ERCP检查发现BismuthIIIa狭窄，胆管刷取物和活检检测均为腺癌阳性，相应BiliSeq检测发现ERBB2扩增，TP53和CDKN2A拷贝数缺失。病人转诊进行肝移植，但经进一步检查发现7/8肝段有2.6cm转移灶（Figure2C），血清CA19-9为U/mL。患者开始按照肝门周胆管癌进行治疗，服用吉西他滨、顺铂和曲妥珠单抗；三个月后，病人血清CA19-9正常为9.4U/mL；八个月后，病人活得很好，血清CA19-9在正常范围内，转移灶最大尺寸降至0.7cm（Figure2D）。

4.结论

本研究前瞻性地研究了基于NGS的分子检测（BiliSeq）技术在评估胆管狭窄中的作用。结果表明临床中BiliSeq与常规病理学评价的联合应用可以提高良恶性胆管狭窄的诊断。此外，BiliSeq还具有识别靶向基因组改变的潜力，可针对不同的患者制定特定的化疗方案。未来的研究还需要探索BiliSeq及类似的基于NSG的检测方法应用到胆管狭窄患者的监测和治疗中。

5.设计思路

目前，尽管已有的胆管良恶性狭窄鉴定方法有所进步，但是这些评价方法一方面需要对患者进行重复样品采集，使患者经受一次次的痛苦；另一方面确诊时间耗时较长，使患者病情加重，错过了最佳的治疗时机。本研究中建立的BiliSeq技术首次应用于良恶性胆管狭窄的诊断，其还具有识别靶向基因组改变的潜力，针对不同的患者制定特定的化疗方案，延长患者的生命。希望你能从本文认识到NGS技术在肿瘤领域的重要应用。

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