专家点评CellStemCell

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余佳（北京协和医学院）、宋春青（西湖大学）责编

兮重症先天性中性粒细胞减少症（SCN）是一种罕见的骨髓衰竭性疾病，以患者外周血中性粒细胞的绝对值减少为主要特征，部分患者还可同时伴有单核细胞升高以及淋巴细胞减少（图1）。超过20个基因被报道与SCN相关，其中ELANE基因突变（种基因突变，位于ELANE基因的编码区和剪接位点）是SCN最常见的致病原因，但是这些ELANE基因突变导致SCN的致病机制却并没有阐释清楚。临床上，虽然G-CSF治疗可以显著提高SCN患者外周血中性粒细胞的数量，但是长期接受G-CSF治疗可增加患者向骨髓增生异常综合征（MDS）/急性髓细胞白血病（AML）转化的风险。因此，探索ELANE基因突变导致SCN的致病机制并寻找SCN的治疗策略是该领域的研究难点。图1SCN患者中性粒细胞发育障碍示意图年1月28日，哈佛医院DanielE.Bauer研究组与麻省大学医学院PeterE.Newburger研究组在CellStemCell杂志上发表了题为DissectingELANEneutropeniapathogenicitybyhumanHSCgeneediting的文章（第一作者为饶书权博士，并列第一作者为姚瑶博士和JosiasSoaresdeBrito博士）。该研究开发了一种采用Sendaivirus和Lentivirus来递送Cas9蛋白和sgRNA的双递送系统，并成功在hematopoieticstemandprogenitorcells（HSPCs）中对ELANE基因的编码区进行了功能筛选，揭示了位于ELANE基因不同区域的移码突变与重症先天性粒细胞减少症疾病表型的关系，同时在细胞模型和小鼠模型中阐释了移码突变的致病机制，提出了新的治疗重症先天性中性粒细胞减少症的策略，为该病的基础和临床研究提供重要参考。高通量CRISPR/Cas功能筛选通过在全基因组范围或者目标区域内干扰基因功能来筛选目的表型，是剖析基因功能和探索疾病机制的重要工具。由于原代细胞不能稳定表达Cas蛋白，如何实现在原代细胞中开展高通量CRISPR/Cas功能筛选一直是领域的难点。在该工作中，研究者首先与西奈山医学院BenhurLee教授合作，充分利用Sendaivirus载体容量大、病毒滴度高以及在真核细胞内表达时间长等特点，开发了利用Sendaivirus和Lentivirus来分别递送Cas9蛋白和sgRNA的双递送系统。研究者在HSPCs中利用该系统对ELANE基因的整个编码区进行了CRISPR/Cas9功能筛选，发现靶向ELANE基因晚期外显子的sgRNAs能显著导致中性粒细胞的发育障碍，而靶向ELANE基因早期外显子的sgRNAs与中性粒细胞的发育无显著关联。由于CRISPR/Cas9基因编辑主要导致编码区的移码，因此研究者推测位于ELANE基因早期外显子的移码突变可能会触发无义介导的mRNA降解，而位于ELANE基因晚期外显子的移码突变则会避免无义介导的mRNA降解，因此对中性粒细胞的发育具有不同的影响。随后，研究者挑选出多个分别靶向ELANE基因早期和晚期外显子的候选sgRNAs，并在细胞模型和小鼠移植模型中来验证上述假说。与预期相符，靶向ELANE基因早期外显子的sgRNAs，可以有效触发无义介导的mRNA降解，导致ELANEmRNA和蛋白水平下降，但并不影响中性粒细胞的正常发育；而靶向ELANE晚期外显子的sgRNA则具有完全相反的效果。基于上述结果，研究者提出了第一种采用CRISPR/Cas9治疗重症先天性中性粒细胞减少症的策略，即通过CRISPR/Cas9在ELANE基因的早期外显子引入移码突变来降解突变的ELANEmRNA。另一方面，研究者们则探讨了位于ELANE基因晚期外显子的移码突变导致中性粒细胞发育障碍的致病机制，并意外发现晚期外显子缺失1个碱基的移码（frame-1）与缺失两个碱基的移码（frame-2）具有完全相反的效果，即只有frame-1会导致中性粒细胞减少症，而frame-2并不影响中性粒细胞的正常发育。深入研究发现，位于ELANE基因晚期外显子的frame-1会导致开放阅读框缩短，能正常表ELANE突变蛋白；相反，frame-2会延长开放阅读框，ELANEmRNA的翻译效率下降，从而下调ELANE突变蛋白的表达。于是，研究者提出了第二种治疗重症中性粒细胞减少症的策略，即通过在ELANE基因晚期外显子引入frame-2移码突变，来降低ELANEmRNA的翻译效率。综上，该研究开发了一种新的CRISPR/Cas9递送系统，并首次在HSPCs中对ELANE基因编码区进行了功能筛选，阐明了位于ELANE基因早期和晚期外显子不同类型的移码突变对中性粒细胞发育的影响，并深入揭示了移码突变导致中性粒细胞发育障碍的分子机制，同时提出了两种不同的治疗重症中性粒细胞减少症的基因治疗策略（图2）。该项工作的基因治疗部分曾在年美国血液学年会（ASHMeeting）上做主题报告（Plenarytalk），遗传学部分曾在年美国人类遗传学大会（ASHGMeeting）上做主题报告（Plenarytalk）。论文第一作者饶书权博士同时获得EpsteinAward（ASHGMeeting）和MeritoriousAbstractTravelAward（ASGCTMeeting）。饶书权为北京协和医学院基础医学研究所沈岩/许琪组毕业的博士，现为哈佛医院DanielE.Bauer研究组博士后。饶书权博士长期致力于常见疾病和罕见疾病的分子遗传学研究，综合运用生物信息学、干细胞培养/移植以及基因编辑等技术手段，探索疾病的发病机制和基因治疗途径。近五年以第一作者和/或通讯作者在CellStemCell、GenomeMedicine、SignalTransductionandTargetedTherapy、AmericanJournalofHumanGenetics、SchizophreniaBulletin、BritishJournalofPsychiatry、HumanGenetics等国际学术期刊上发表论文10余篇，被引用余次。联系邮箱：shuquan.rao